На данной странице представлена ознакомительная часть выбранного Вами патента

Вернуться к списку

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО МОНОКОМПОНЕНТНОГО ИНСУЛИНА

Номер публикации патента: 95109646

Вид документа:  A1  Страна публикации:  RU  Рег. номер заявки:  95109646

Реферат

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к способу получения высокоочищенного монокомпонентного инсулина животного происхождения, применяемого для лечения сахарного диабета. Цель: повышение качества и выхода монокомпонентного инсулина. Способ заключается в том, что натрий инсулин с содержанием монофракии не менее 85% растворяют в 0,018-0,022 М фосфатном буфер при pH - 6,7-6,8 и подают в хроматографическую колонну, предварительно заполненную уравновешенным в том же буфере макропористым сульфокатионитом КУ - 23И с диаметром частиц от 200 до 300 мкм. Элюируют инсулин при комнатной температуре 0,018-0,022 М фосфатным буфером линейным в течение 2-3 объемов насадки в колонне градиентом по значению pH: от pH= 6,7-6,8 до pH=7,9-8,0. Из полученного элюата выделяют инсулин изоэлектрическим осаждением. Полученный после катионообменной хроматографии на КУ-23И инсулин растворяют в 1 М уксусной кислоте и подают в хроматографическую колонну, предварительно заполненную сефадексом G-50 sf фирмы Pharmacia, уравновешенным в 1 м уксусной кислоте и термостатированную при температуре от 4 до 6^oС. При этой же температуре проводят элюирование инсулина 1 М уксусной кислотой со скоростью от 5 до 13 мл/см² · час^-1. Часть элюата,которая содержит инсулин и которая элюируется в интервале от 6-0,7 до 0,9-1,0 объема насадки в колонне, направляют на вход колонны для рециркуляции и продолжают элюирование 1 М уксусной кислотой. Монопиковый инсулин выделяют из части элюата, которая элюируется в интервале от 1,45-1,50 до 1,75-1,85 объема насадки в колонне. Полученный после циркуляционной гельпроникающей хроматографии монопиковый инсулин растворяют в буфере следующего состава: 35-45 мМ Трис/HCL, 10- 20 мМ трилона Б, 50-60% (объемных) этанола с pH=7,8- 8,5. Этим же буфером уравновешивают помещенный в хроматографическую колонну анионообменный силикагель РАЕ-300 фирма Amicon с размером частиц от 35 до 70 мкм. Полученный раствор монопикового инсулина с содержанием инсулина от 2 до 2,5% и с общим количеством инсулина от 3 до 10 г/л насадки при температуре от 6 до 8^oС подают в хроматографическую колонну. Элюируют инсулин при температуре от 6 до 8^oС со скоростью от 20 до 45 мл/см² · час^-1 элюентом, состоящим из 33-45 мМ Трис/HCl, 10 ^oC 20 мМ трилона Б, 50-60% (объемных) этанола с pH= 7,8- 8,5, используя экспоненциальный градиент по концентрации хлористого натрия. Для этого в течение 4,5-5,5 объемов насадки в колонне концентрацию хлористого натрия в элюенте увеличивают от 0 до 1,0 М, соблюдая следующую зависимость: С = К * е^N, где С - концентрация NaCl в элюенте, М/л; К - коэффициент крутизны градиента, К= 0,0041-0,0111; е - основание натурального логарифма, е= 2,71828 ...; N - отношение объема элюента к объему насадки в колонне. Высокоочищенный монокомпонентный инсулин выделяют из элюата в виде кристаллического цинка инсулина. Полученный инсулин содержит не менее 98,5% монофракции, не более 0,5% дезамидоинсулина, не более 1,0% неидентифицированных примесей (метод ВЭЖХ) и не более 10 п.п.м. проинсулина и его производных. При этом выход по массе составляет от 55 до 65% от исходной субстанции натрий инсулина.

Вернуться к списку